elispot

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隨著酶聯免疫分析技術在醫學及生物學領域的廣泛套用,使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應答機制時以往常用用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測體液中游離的細胞因子(CK)或抗體,但由於游離的循環抗體或CK的半衰期不同,使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合,而不能確切的反映體內的抗體及CK的水平。80年代,國外的科研工作者根據ELISA技術的基本原理,建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯免疫斑點技術(ELISPOT)。

區別

ELISPOT法源自ELISA,又突破傳統ELISA法,是定量ELISA技術的延伸和新的發展。兩者都是檢測細胞產生的細胞因子或其他可溶性蛋白,它們最大的不同在於:

1、ELISA通過顯色反應,在酶標儀上測定吸光度,與標準曲線比較得出定量的可溶性蛋白總量。

2、ELISPOT通過顯色反應,在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點,可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過ELISPOT分析系統對斑點進行計數,1個斑點代表1個活性細胞,從而計算出分泌該蛋白或者細胞因子的細胞的頻率。(某些研究不僅要測細胞因子生成量,還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率)

3、由於是單細胞水平檢測,ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏,能從 20萬-30萬 細胞中檢出 1個 分泌該蛋白的細胞。

4、捕獲抗體為瑞典高科技生物公司MABTECH, BD、R&D、生產的高親和力、高特異性、低內毒素單抗,在研究者以刺激劑激活細胞時,不會影響活化細胞分泌細胞因子。

檢測原理

細胞受到刺激後局部產生細胞因子,此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解後, 被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合,其後再與鹼性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT底物孵育後,PVDF孔板出現“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子,通過ELISPOT酶聯斑點分析系統對斑點的分析後得出結果.

套用領域

移植中排斥反應的預測、疫苗發展、Th1/Th2分析、自身免疫病研究、腫瘤研究、過敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原決定簇圖譜分析、化合物和藥物免疫學反應的篩選等等。

現介紹檢測人IFNγ為例的PVDF Eli-spot法,僅供參考。

試劑盒內容:PVDF96孔板,室溫保存;0.1ml捕獲抗體,4℃保存;0.1ml生物素標記檢測抗體,4℃保存;15ul親和素鹼性磷酸酶標,4℃保存;0.25g牛血清白蛋白,4℃保存;0.25g脫脂乳,4℃保存;11ml底物緩衝液,4℃保存;11ml濃縮PBS(10X),室溫保存;11ml濃縮洗滌液(200x),室溫保存

自備材料/試劑: 細胞培養液,CO2孵育箱,70%酒精

直接間接法

可在已包被抗體的孔中直接刺激細胞(直接法),或在24孔板或燒瓶中先刺激細胞,然後放入已包被的孔中(間接法)。使用哪種方法基於:1)檢測細胞的類型;2)希望得到的細胞量。如果細胞生成只需少量的細胞因子,使用直接法;如果細胞生成細胞因子較多,最好使用間接法。其它步驟一致。

刺激方法:建議用PMA和婁諾黴素刺激PBMC,使其產生IFNγ。

在培養液中稀釋PBMC(如:RPMI 1640加2mM谷氨酸鹽和10%加熱失活的小牛血清),其中含1ng/ml PMA和500ng/ml婁諾黴素(Sigma, Saint Louis, MO)。加5X104至3x105個細胞到抗體包被的PVDF孔,孵育箱中孵育10-15小時。其它的刺激劑孵育時間可能不同,基於細胞因子生成細胞的量,按不同情況作最佳選擇。

試劑的準備:1. 10ml磷酸緩衝鹽(PBS,10X)以90ml蒸餾水稀釋;2. 0.22g脫脂乳用11ml稀釋的PBS溶解,最終濃度為2%;3. 0.22gBSA溶解於22ml已稀釋的PBS,最終濃度為1%;4. 10ml濃縮洗滌液(200x)以1990ml蒸餾水稀釋;5. 10ul親和素鹼性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀釋6. 7ml酒精以3ml蒸餾水稀釋,最終濃度為70%。

操作過程

1. 用50ul 70%酒精孵育PVDF孔板,室溫下孵育1分鐘。

2. 倒去酒精,用100ul PBS洗滌3次。

3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中,混合, 每孔加100ul, 蓋上板蓋,4℃過夜。

4.倒去液體,100ul PBS洗滌一次。

5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS(見試劑準備),蓋上板蓋,室溫下孵育2小時。

6.在水槽邊和吸水紙上輕打,倒去液體。

7.用100ul PBS洗滌一次。

8.每孔加入100ul細胞懸浮液(含適當量的細胞和相應濃度的刺激劑)。細胞可預先在體外接受刺激(間接Eli-spot)。蓋上標準的96孔板塑膠板蓋,37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時間(15-20小時)。這期間不要晃動或移動孔板。

9.在水槽邊和吸水紙上輕打,倒去液體。

10.每孔加100ul洗滌緩衝液,4℃孵育10分鐘。

11.用100ul洗滌緩衝液洗孔3次。

12.於10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體,此為一板的量。每孔加100ul此液體,蓋上板蓋,室溫下孵育2小時 。

13.倒去液體,用100ul洗滌緩衝液洗3次。

14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素鹼性磷酸酶。每孔加入100ul此液體,蓋上板蓋,室溫下孵育1小時。

15.倒去液體,用100ul洗滌緩衝液洗3次。在吸水紙上拍打,吸乾殘留的洗滌液。

16.每孔加入100ul BCIP/NBT。

17.室溫下反應5-15分鐘。完全顯色後,將此液倒於相應的盤中。

18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍,使膜乾燥。保存時,將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜乾燥後,讀取點數。4℃下放置一夜,點會比較明顯。

此板在室溫下避光保存。

使用時應注意BCIP/NBT緩衝液是潛在的至癌物質,試驗時帶手套,使用後適當處理。對MAIPAN4510板,孵育時由於毛細作用,試劑滲入膜中,此液體難以洗去,因此導致背景增加。為了避免此情況,建議在步驟12時將板底移去,將膜倒轉,用蒸餾水流沖洗,同時用洗滌緩衝液按正常的步驟洗滌。在步驟14中,由於板底已移去,建議將MAIP4510板放於空的96孔板上,其後的步驟不變。

預包被

利用預包被工藝將捕獲抗體包被於PVDF板上,真空乾燥後保存。用時先以細胞培養基活化(100ul/孔),後直接加入待測細胞懸液進行孵育,後續步驟同上。大大減少了實驗時間,提高了效率。

刺激劑選用

檢測T淋巴細胞功能最常用的方法是用非特異性激活劑(如Con A),植物凝集素PHA, 佛波醇酯PMA, 婁諾黴素+PMA等;而檢測B淋巴細胞功能最常用脂多糖PS, 美洲商陸PWN,葡萄球菌A-SAC來激活。其中Con A一般適用於小鼠;PHA適用於人,對小鼠有一定效果;婁諾黴素(Ionomycin)+PMA對人鼠皆有效果,且適用於IFNγ和IL-4等多種細胞因子。

關於實驗步驟

1. 封閉步驟可用FBS、BSA、酪蛋白等代替脫脂乳,效果會更好,但價格較高,。

2. 孵育後細胞裂解可使用低鹽溶液或去離子水,4℃孵育10分鐘,低滲裂解細胞。

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