變性DNA

DNA雙螺鏇結構模型,不僅與其生物功能有密切關係,還能解釋DNA的重要特性棗變性與復性,這對於深入了解DNA分子結構與功能的關係又有重要意義。DNA的變性和復性原理,現已在醫學和生命科學上得到廣泛的套用。如核酸雜交與探針技術,聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)技術等。

1.DNA變性(denaturation)

指DNA分子由穩定的雙螺鏇結構松解為無規則線性結構的現象。變性時維持雙螺鏇穩定性的氫鍵斷裂,鹼基間的堆積力遭到破壞,但不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺鏇穩定性的因素,如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲醯胺等,均可引起核酸分子變性。變性DNA常發生一些理化及生物學性質的改變:

溶液粘度降低。DNA雙螺鏇是緊密的剛性結構,變性後代之以柔軟而鬆散的無規則單股線性結構,DNA粘度因此而明顯下降。

溶液鏇光性發生改變。變性後整個DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變,使DNA溶液的鏇光性發生變化。

15-8 核酸的解鏈曲線

增色效應(hyperchromiceffect)。指變性後DNA溶液的紫外吸收作用增強的效應。DNA分子中鹼基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺鏇結構中鹼基藏入內側,變性時DNA雙螺鏇解開,於是鹼基外露,鹼基中電子的相互作用更有利於紫外吸收,故而產生增色效應。

對雙鏈DNA進行加熱變性,當溫度升高到一定高度時,DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值,隨後即使溫度繼續升高,吸光度也不再明顯變化。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖,得到的典型DNA變性曲線呈S型(圖158)。可見DNA變性是在一個很窄的溫度範圍內發生的。通常將核酸加熱變性過程中,紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為核酸的解鏈溫度,由於這一現象和結晶的融解相類似,又稱融解溫度(Tm,meltingtemperature)。在Tm時,核酸分子內50%的雙螺鏇結構被破壞。特定核酸分子的Tm值與其G+C所占總鹼基數的百分比成正相關,兩者的關係可表示為:

Tm=69.3+0.41(%G+C)

一定條件下(相對較短的核酸分子),Tm值大小還與核酸分子的長度有關,核酸分子越長,Tm值越大;另外,溶液的離子強度較低時,Tm值較低,融點範圍也較寬,反之亦然,因此DNA製劑不應保存在離子強度過低的溶液中。

2.DNA復性(renaturation)

指變性DNA在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺鏇結構的現象,它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻後即可復性,此過程稱之為退火(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成(見後)。DNA的復性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響:

溫度和時間。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件,越遠離此溫度,復性速度就越慢。復性時溫度下降必須是一緩慢過程,若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下),復性幾乎是不可能的,核酸實驗中經常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利於復性。

DNA濃度。溶液中DNA分子越多,相互碰撞結合的機會越大。

DNA順序的複雜性。簡單順序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復性時,互補鹼基的配對較易實現。而順序複雜的序列要實現互補,則困難得多。在核酸復性研究中,定義了一個Cot的術語,(Co為單鏈DNA的起始濃度,t是以秒為單位的時間),用以表示復性速度與DNA順序複雜性的關係。在探討DNA順序對復性速度的影響時,將溫度、溶劑離子強度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定,以不同程度的核酸分子重締合部分(在時間t時的復性率)對Cot作圖,可以得到如圖15-9所示的曲線。曲線上方為示複雜性的核酸分子的非重複鹼基對數。如多聚(A)的複雜性為1,重複的(ATGC)n組成的多聚體的複雜性為4,分子長度是105核苷酸對的非重複DNA的複雜性為105。原核生物基因組均為非重複順序,故以非重複核苷酸對表示的複雜性直接體現基因組大小(圖上方的箭頭所指為基因大小),對於真核生物基因組中的非重複片段也是如此。在標準條件下(一般為0.18ml/L陽離子濃度,400核苷酸長的片段)測得的復性率達0.5時的Cot值(稱Cot1/2),與核苷酸對的複雜性成正比。對於原核生物核酸分子,此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的複雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重複序列(repetitivesequence),所得到的Cot曲線更為複雜。

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參考連結

1、http://www.helixnet.cn/archiver/tid-2721.html
2、
http://scitech.people.com.cn/GB/other2137/3、http://book.sina.com.cn/nzt/spi/gongzuodna/

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