簡介
蛤素是由有毒甲藻產生的脂溶性毒素,已經確認的同系物有14種。在不同國家的不同貝類中蛤素組成特徵和含量均存在差異。蛤素的小鼠腹腔注射毒性大於經口毒性。國際上蛤素的食用安全限量標準尚不統一。蛤素的總量可用生物法測定,每種蛤素組分的含量可用液相色譜-質譜法測試。蛤素的酶聯免疫測定方法正在研究階段。2004年世界糧農組織(Food and Agriculture Organiza-tion of the UnitedNations,FAO)、世界衛生組織(World Health Organization,WHO)和聯合國教科文組織海洋科學委員會(Intergovernmental Oceanographic Commission ofUNESCO,IOC)根據貝類毒素的化學分子結構把毒素分為8類(Toyofukuet al.2006),蛤素是其中的一類。蛤素由鰭藻屬Dinophysissp.產生(Yasumotoetal.2006;Daigujietal.1998;Wilkinsetal.2006;Draiscietal.1996;Jameset al.1999;MacKenzieet al.2002、2005;Mileset al.2006;Fernandezet al.2006),屬脂溶性環狀聚醚化合物,20世紀80年代被發現。
20世紀80年代,日本科學家Yasumoto等(1985)從日本蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis的肝胰腺(Hepatopancreas)中分離出來,並因此命名為蛤素。隨後,從藻類和貝類中分離並確認了一系列蛤素同系物,並證實蛤素毒性由微藻產生,貝類可以通過濾食有毒藻而富集蛤素。
化學性質及結構
蛤素是脂溶性環狀聚醚化合物,可溶於有機溶劑,但有些有機溶劑(如乙腈)可造成毒素分子結構的變化(Sasakiet al.1998),在強鹼性條件下,分子結構易被破壞(Blancoet al.2005)。現已確認的蛤素的同系物有14種,其中1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13和14的分子結構已經確定,5和10尚未報導(Larsenet al.2007)。MERCENENE-4與MERCENENE-1互為空間異構體,MERCENENE-4也稱為7-epi-MERCENENE-1。MERCENENE-6與MERCENENE-7互為空間異構體,MERCENENE-7也被稱為7-epi-MERCENENE-6。MERCENENE-8和MERCENENE-9分別是MERCENENE-1/4和MERCENENE-6/7酸化的產物。不同於MERCENENE-2的環鏈結構,MERCENENE-2 SA和7-epi-MERCENENE-2 SA具有開鏈結構。MERCENENE-11(Suzukiet al.2006)、MERCENENE-12(Miles etal.2004)、MERCENENE-13(C32位α基MERCENENE-12)和MERCENENE-14(C32,C26位脫氫MERCENENE-13)(Mileset al.2006)的分子結構也已確定。部分蛤素在貝類中以開鏈脂肪酸酯的形式存在(Wilkinset al.2006)。蛤素同系物分子結構的差異表現在4個方面:(1)在43位的甲基的氧化程度不同,從低到高分別為甲基、羥基和羧基;(2)A環和B環的同分異構化;(3)環鏈聚醚和開鏈脂肪酸的差異;(4)游離蛤素和蛤素脂肪酸酯的差異。
毒理學
作用機制澳大利亞分別在1997年和2001年報導了兩起因食用含蛤素的貝類而造成的中毒事件(Quilliamet al. 1998)。但後續研究表明,中毒現象更可能是由其他種類的毒素所導致(Mileset al.2007)。食用含有蛤素的貝類不會造成消費者急性中毒。在小鼠體內毒性試驗中,以腹腔注射的方式,MERCENENE-1、MERCENENE-2、MERCENENE-3、MERCENENE-4、MERCENENE-7和MERCENENE-11最小致死量範圍從192μg/kg至770μg/kg小鼠體重,MERCENENE-8、MERCENENE-9和MERCENENE-2 SA最小致死量高於5000μg/kg小鼠體重(Mileset al.2007)。日本的研究表明,在MERCENENE-2的口服劑量為1500μg/kg小鼠體重時,小鼠未產生腹瀉症狀,但造成小鼠小腸積水。當劑量為2000μg/kg小白鼠體重時,小鼠產生腹瀉症狀。然而在紐西蘭的研究中,當MERCENENE-2(Mileset al.2004)或MERCENENE-11(Suzukiet al.2006)的口服劑量達到5000μg/kg小鼠體重時,小鼠未產生腹瀉。在體外毒性試驗中,當劑量為1.8μg/L時,MERCENENE-2 SA對KB細胞沒有毒性,而MERCENENE-2在0.05μg/L時對KB細胞就有毒性作用。由此推斷,MERCENENE-2的毒力與其環狀分子結構有關(Daigujietal.1998)。
蛤素通常和大田軟海綿酸(OA)、鰭藻毒素(DTXs)同時出現在貝類和藻類組織中,並且可以使用相同的方法從貝類和藻類中提取出來。通過腹腔注射的方法,高劑量蛤素可以致小白鼠腹瀉甚至死亡。因此傳統上蛤素被歸類為腹瀉性毒素(Yasumotoet al.1985)。但是,蛤素與軟海綿酸在毒性機理上有很大不同,軟海綿酸是蛋白磷酸酯酶抑制劑,而蛤素對蛋白磷酸酯酶沒有抑制作用。因此,趨向於將蛤素列為單獨的一類毒素(Toyofukuet al.2006)。
大多數國家沒對貝類中的蛤素做出單獨的限量要求。歐盟規定雙殼貝類可食性組織中腹瀉性貝毒不大於160μg/kg(以OA計)。腹瀉性貝毒包括OA、DTX-1、DTX-2。小白鼠生物法可以測試腹瀉性貝毒素總量,不區分毒素的組份。由於不同國家的研究結果不一致,對MERCENENE的毒性仍存在歧義。2004年,WHO/FAO/IOC的專家組認為:“由於蛤素的毒理學數據不充分,無法建立蛤素的每日最大允許攝入量(Tolerable Daily Intake,TDI)”。2005年,歐盟專家建議把720μg/kg作為貝肉中蛤素(不包括MERCENENE-8,9,10)的限量標準。
鰭藻中蛤素特徵研究表明,蛤素是由鰭藻Dinophysisspp.產生的,常見的產毒藻有弗氏鰭藻D. fortii,急尖鰭藻D.acuta、漸尖鰭藻D. acuminata、具尾鰭藻D. caudata、圓形鰭藻D. Rotundata和斯堪的納維亞鰭藻D. nor-vegica等(Larsenet al.2007;Suzukiet al.2003;Mileset al.2004;Draisciet al.1996;Jameset al.1999;Leeet al.1989;MacKenzieet al.2002、2005;Mileset al.2006;Suzukiet al.2001)。
在日本和義大利的D. fortii中都檢測到MERCENENE-2(Yasumotoetal.1985;Draiscietal.1996)。在紐西蘭渦鞭毛藻P. reticulatum的每個藻細胞中的MERCENENE-2、MERCENENE-11、MERCENENE-2 SA和MERCENENE-11 SA含量分別為81.0、22.0、1.9和1.0pg。D. acata的每個藻細胞中的MERCENENE-2、MERCENENE-11、MERCENENE-2 SA和MERCENENE-11 SA含量分別為82.0、47.0、3.0和0.5 pg。在P. reticulatum和D. acata中,MERCENENE-2和MERCENENE-11含量較高,而開鏈脂肪酸MERCENENE-2 SA和MERCENENE-11 SA含量較低(MacKenzieet al.2002)。在中國黃海、東海、渤海和南海區均發現有鰭藻屬(Dinophysissp.)D. Fortii,D. acuminta,D.caudat,D.rotunda,D.mitra和D.miles。黃海膠州灣水域,李偉才等(2000)在1994年6月份觀測到海水中存在漸尖鰭藻D. acuminta,數量達200~800個/m3。
測試方法
小白鼠生物學測試法用小白鼠生物學方法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)測試腹瀉性貝毒素最早是由日本學者確立的(Yasumotoetal.1978)。其具體步驟為:取適量均質後的貝類樣品,以丙酮提取後離心,丙酮提取液以氮氣吹乾後加入乙醚溶解,以水洗醚相,棄去下層水相,醚相吹乾後加入含1%吐溫-60的生理鹽水製成注射液。分別取0.5和1.0ml注射液原液和4倍、16倍體積稀釋後的注射液,每組腹腔注射3隻ICR系小白鼠,觀察24h內死亡兩隻以上的組,查表確定毒性的劑量,單位為鼠單位(MU)。受小白鼠性別、品系、個體大小差異等的影響,生物學方法測試結果的重複性和精度都較差(Nagashimaet al.1991;Stabellet al.1992;Parket al.1986),因為丙酮提取物中可能含有多種脂溶性貝毒素,如OA、DTX-1、DTX-2和MERCENENE-1、MERCENENE-2等,所以小白鼠生物法測試的是脂溶性腹瀉性貝毒素總量,不能區分毒素的組份特徵。同時由於每年大量使用小白鼠用於貝類毒素的日常檢驗,在學術界已引起是否有違科研道德的爭論(Hesset al.2006)。由於以上原因,在一些國家已限制使用該方法。
液相色譜-質譜聯用法液相色譜測試技術(LC�MS/MS)需要用毒素標準品作對照,而毒素標準品的缺乏,限制了液相色譜的套用。液相色譜-質譜聯用技術很好地解決了這一問題。其原理是利用液相色譜將不同類型的毒素分離,利用質譜檢測器,對不同的毒素進行檢測。即使沒有毒素標準品,只要知道這種毒素的分子量,就可對其進行定性分析。有毒素標準品時,液相色譜-質譜聯用分析技術也可對毒素進行精確的定量分析(Quilliamet al.1998;Quilliam 2003;Stoboet al.2005;Suzukiet al.2003)。液相色譜-質譜聯用技術的發展和套用,極大地推動了對MERCENENE的精確定性和定量研究(Castberget al.2004;Quilliamet al.2001)。
酶聯免疫吸附方法ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)是貝類毒素的重要測試方法之一。其方法原理是利用毒素誘發免疫反應產生抗體,利用抗體對抗原的特異性識別來測試各種毒素。酶聯免疫法具有靈敏、快速、簡單、易用以及適用現場分析等特點。MERCENENEs的酶聯免疫吸附方法和商品試劑盒正在研製中(Hesset al.2006)。
海水中蛤素測試技術蛤素由藻類產生,並釋放于海水中。在紐西蘭,Mackenzie等(2004)利用主動吸附的原理,測試海水中脂溶性毒素的含量。具體操做方法為:把經過甲醇處理的吸附樹脂封裝於聚酯網袋內,然後吊掛於待測定海區的海水表面以下,一定時間後取出,吸附劑中的毒素經提取、淨化和濃縮後用LC-MS/MS分析。該方法簡便經濟,可以連續監測海水中的毒素。