藥物敏感試驗

藥物敏感試驗

藥物敏感試驗簡稱藥敏試驗(或耐藥試驗)。旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感(或耐受)程度,以指導臨床合理選用抗生素藥物的微生物學試驗。一種抗生素如果以很小的劑量便可抑制、殺滅致病菌,則稱該種致病菌對該抗生素“敏感”。反之,則稱為“不敏感”或“耐藥”。為了解致病菌對哪種抗菌素敏感,以合理用藥,減少盲目性,往往應進行藥敏試驗。其大致方法是:從病人的感染部位採取含致病菌的標本,接種在適當的培養基上,於一定條件下培養;同時將分別沾有一定量各種抗生素的紙片貼在培養基表面(或用不鏽鋼圈,內放定量抗生素溶液),培養一定時間後觀察結果。由於致病菌對各種抗生素的敏感程度不同,在藥物紙片周圍便出現不同大小的抑制病菌生長而形成的“空圈”,稱為抑菌圈。抑菌圈大小與致病菌對各種抗生素的敏感程度成正比關係。於是可以根據試驗結果有針對性地選用抗生素。近年已有自動化的藥敏試驗儀器問世,使試驗更加迅速、準確。目前濫用抗生素,致使抗藥菌增加,甚至因長期大量使用廣譜抗生素,殺傷體內正常微生物,失去微生物的相互制約作用,從而使一些少見的或一般情況下的非致病菌大量繁殖,引起所謂“二次感染”的情況屢有發生,給治療造成人為的困難。因此,提倡使用藥敏試驗,堅持合理用藥十分重要。

藥物敏感試驗的方法

目前常用的藥敏試驗方法有:紙片瓊脂擴散法(K-B法)、稀釋法、E試驗、檢測細菌耐藥性的方法。稀釋法分液體稀釋法和瓊脂稀釋法。檢測細菌耐藥性的方法包括 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的檢測、耐萬古黴素腸球菌(VER)的檢測、耐青黴素肺炎鏈球菌(PRP)的檢測、超廣譜 β-內醯胺酶(ESBL)的檢測和β-內醯胺酶的檢測。

實驗步驟

實驗材料

1.1普通營養瓊脂培養基:可去生化試劑店購買,做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養基,如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥糠凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。

1.2藥敏試紙:購買或自製(詳見實驗準備)

1.3細菌:待做藥敏試驗的細菌

1.4接種環、 酒精燈、打孔器、 牛津杯

1.5移液器、 滴頭

實驗準備

2.1藥敏片的準備:購買或自製

2.1.1藥敏片的製備:取新華1號定性濾紙,用 打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔乾燥的青黴素空瓶中,瓶口以單層 牛皮紙包紮。經15磅15-20分鐘高壓消毒後,放在37℃溫箱或 烘箱中數天,使完全乾燥。

2.2.2抗菌藥紙片製作:在上述含有50片紙片的青黴素瓶內加入藥液0.25毫升,並翻動紙片,使各紙片充分浸透藥液,翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱,放37℃溫箱內過夜,乾燥後即密蓋,如有條件可 真空乾燥。切勿受潮,置陰暗乾燥處存放,有效期3-6個月。各種常用藥的藥液配製詳見表-2

2.2藥液的製備(用於商品藥的試驗):按商品藥的使用治療量的比例配製藥液;如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水,可按這個比例配製藥液,可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用於做藥敏試驗的藥液。

實驗操作方法

3.1藥敏片法

3.1.1在“ 超淨台”中,用經(酒精燈)火焰滅菌的接種環挑取適量 細菌培養物,以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式;用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌,以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後,找到第二點劃線至平皿的1/2,依次劃線,直至細菌均勻密布 於平皿。(另:可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌 混懸液,用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密)

3.1.2將鑷子於酒精燈火焰滅菌後略停,取藥敏片貼到平皿培養基表面。為了使藥敏片與培養基緊密相貼,可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果,要求藥敏片能有規律的分布於平皿培養基上;一般可在平皿中央貼一片,外周可等距離貼若干片(外周一般可貼七片),每種藥敏片的名稱要記住。

3.1.3將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後,觀察效果。

3.2 牛津杯法

3.2.1在“超淨台”中,用經(酒精燈)火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物,以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式;用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌,以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後,找到第二點劃線至平皿的1/2,依次劃線,直至細菌均勻密布於平皿。(另:可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液,用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密)

3.2.2以 無菌操作將滅菌的不鏽鋼小管(內徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管,管的兩端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培養基上,輕輕加壓,使其與培養基接觸無空隙,並在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。待分鐘後,分別向各小管中滴加一定數量的各種藥液,勿使其外溢。置37℃培養8-18小時,觀察結果。

3.2.3將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後,觀察效果。

3.3打孔法:該法較簡單,成本低,易操作,比較適用於商品藥物的檢測。

3.3.1在“超淨台”中,用經(酒精燈)火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物,以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式;用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌,以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後,找到第二點劃線至平皿的1/2,依次劃線,直至細菌均勻密布於平皿。(另:可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液,用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密)

3.3.2以無菌操作將滅菌的不鏽鋼小管(外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米,管的兩端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培養基上打孔,將 孔中的培養基用針頭挑出,並以火焰 封底,使培養基能充分的與平皿融合(以防藥液滲漏,影響結果)。

3.3.3加樣:按不同藥液加樣,樣品加至滿而不溢為止。

3.3.4將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後,觀察效果。

結果觀察

在塗有細菌的瓊脂平板上,抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散,其濃度呈梯度遞減,因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑制。過夜培養後形成一個 抑菌圈,抑菌圈越大,說明該菌對此藥敏感性越大,反之越小,若無抑菌圈,則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關係。

判定標準

1.藥敏實驗的結果,應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。

表—1藥物敏感實驗判定標準

抑菌圈直徑(毫米)敏感度

20以上極敏

15—20 高敏

10—14中敏

10以下低敏

0不敏

2.藥物敏感實驗判定標準參考表—1, 多黏菌素抑菌圈;在9毫米以上為高敏,6—9毫米為低敏,無抑菌圈為不敏。

影響藥敏結果的因素

培養基

應根據試驗菌的營養需要進行配製。傾注平板時,厚度合適(約5-6mm),不可太薄,一般90mm直徑的 培養皿,傾注培養基18-20ml為宜。培養基內應儘量避免有抗菌藥物的拮抗物質,如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的 抗菌活性, 胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸(PABA)能拮抗 磺胺藥和 TMP的活性。

細菌接種量

細菌接種量應恆定,如太多,抑菌圈變小,能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。

藥物濃度

藥物的濃度和總量直接影響 抑菌試驗的結果,需精確配製。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配製。

培養時間

一般培養溫度和時間為37℃8-18小時,有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素,可將已放好抗菌藥的平板培養基,先置4℃冰櫃內2-4小時,使抗菌藥預擴散,然後再放37℃溫箱中培養,可以推遲細菌的生長,而得到較大的抑菌圈。

套用

藥物敏感實驗後,應選擇高敏藥物進行治療,也可選用兩種藥物協助使用,以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑,因為我們藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸,而在給禽用藥的時候,必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果,所以在給禽用藥時,高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法,這樣才會達到好的治療效果。

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