介紹
甲醇酵母基因表達系統是一種最近發展迅速的外源蛋白質生產系統。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三種，其中Pichia Pastoris作為基因表達系統使用得最多、最廣泛［1］。與以往的基因表達系統相比，它具有無可匹敵的高表達特性，已被認為是最具有發展前景的生產蛋白質的工具之一。
1. 外源蛋白質的基因在甲醇酵母中的高效表達
目前已有多種蛋白質的基因在該表達系統中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等(表1)。儘管各種外源蛋白質產生的水平不一，但各種蛋白質在甲醇酵母中的產生水平均為在細菌、昆蟲或哺乳動物等表達系統中產量的10～100倍［2］。如表皮生長因子(EGF)在釀酒酵母中的產量為7.4mg/L，而在甲醇酵母中為450mg/L，提高了60倍［3］。椐報導，外源蛋白質在甲醇酵母中的產量最高可達12g/L［9］。
2. 實現外源蛋白質高效產生的關鍵因素
2.1 表達載體首先，甲醇酵母中沒有穩定的質粒，所以其表達載體採用整合型質粒。利用醇氧化酶(甲醇代謝的關鍵酶)基因-1(AOX1)的啟動子(PAOX1)和轉錄終止子(3′AOX1)構建成整合型表達載體。PAOX1是一個極強的啟動子，醇氧化酶的產量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白質的30%［2］，所以能使外源蛋白質在它的控制下高效產生。其次，在載體中加入釀酒酵母的分泌信號和前導肽序列(α因子)構建分泌型載體，一方面可以減輕宿主細胞的代謝負荷，另一方面可以減少宿主細胞蛋白水解酶對外源蛋白質的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均為此類載體。此外，使多拷貝目的基因整合入甲醇酵母染色體，形成多個表達單元，產生高產的菌株，此類載體有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
2.2 受體菌 在以葡萄糖或甘油為碳源的培養基上生長時，甲醇酵母中AOX1基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時，誘導基因表達，使外源蛋白質的產量更高。甲醇酵母適合高密度連續培養的條件，細胞乾重達100g/L以上，蛋白質產量極高［14］。受體菌採用蛋白水解酶缺陷型，從而大大降低產物的降解。常用的甲醇酵母受體菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。
3. 套用前景
經過近幾年的發展完善，甲醇酵母表達系統已日趨成熟，套用也日趨廣泛。國內已有多篇在甲醇酵母中生產外源蛋白質成功的報導(表2)。美國Invitrogen公司也已開發出多種新型的甲醇酵母表達系統試劑盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等，利用甲醇酵母表達系統克隆一個外源基因已十分方便。相信隨著對甲醇酵母研究的進一步深入，它在生產外源蛋白質方面將日益展示出誘人的前景。
