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光柵定位主要是機械滑鼠所使用的方式，不過由於純粹的機械滑鼠現在已經基本消失，這裡的機械滑鼠實際是指光機式滑鼠。滑鼠移動時帶動膠球滾動，膠球的滾動又磨擦滑鼠內的分管水平和垂直兩個方向的柵輪滾軸，驅動柵輪轉動。柵輪的輪沿為格柵狀，緊靠格柵兩側，一側是一紅外發光管，另一側是紅外接收組件。滑鼠的移動轉換為水平和垂直柵輪不同方向和轉速的轉動。柵輪轉動時，柵輪的輪齒周期性遮擋紅外發光管發出的紅外線照射到水平和垂直兩個紅外接收組件，產生脈衝。滑鼠內控制晶片通過兩個脈衝的相位差判知水平或垂直柵輪的轉動方向，通過脈衝的頻率判知柵輪的轉動速度，並不斷通過數據線向主機傳送滑鼠移動信息，主機通過處理使螢幕上的游標同滑鼠同步移動。
軌跡球定位的工作原理和其實與光柵類似，只是改變了滾輪的運動方式，其球座固定不動，直接用手撥動軌跡球來控制滑鼠箭頭的移動。軌跡球被搓動時帶動其左右及上下兩側的滾軸，滾軸上帶有柵輪，通過發光管和接收組件產生脈衝信號進行定位。不過軌跡球的滾輪積大、行程長，這種定位方式能夠作出十分精確的操作。並且軌跡球另一大優點是穩定，通過一根手指來操控定位，不會因為手部動作移動影響定位。此外，現在也有使用光電方式的軌跡球，其工作原理和發光二級管定位類似。
發光二極體定位是大多數光電滑鼠的定位方式，這是一種電眼的工作方式。在光電滑鼠內部有一個發光二極體，通過該發光二極體發出的光線，照亮光電滑鼠底部表面（這就是為什麼滑鼠底部總會發光的原因）。然後將光電滑鼠底部表面反射回的一部分光線，經過一組光學透鏡，傳輸到一個光感應器件（微成像器）內成像。這樣，當光電滑鼠移動時，其移動軌跡便會被記錄為一組高速拍攝的連貫圖像。最後利用光電滑鼠內部的一塊專用圖像分析晶片（DSP，即數字微處理器）對移動軌跡上攝取的一系列圖像進行分析處理，通過對這些圖像上特徵點位置的變化進行分析，來判斷滑鼠的移動方向和移動距離，從而完成游標的定位。
雷射定位也是光電滑鼠的一種定位方式，其特點是使用了雷射來代替發光二極體發出的普通光。雷射是電子受激發出的光，與普通光相比具有極高的單色性和直線性，目前用於定位的雷射主要是不可見光。普通光在不同顏色表面上的反射率並不一致，這就導致光電滑鼠在某些顏色表面上由於光線反射率低，使DSP不能識別的“色盲”問題。此外普通光在透明等物質表面無法使用，或者產生跳動。由於雷射近乎單一的波長能夠更好的識別表面情況，靈敏度大大提高，因此使用雷射定位的滑鼠可以有效解決這些問題。
