《PCR技術》

聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA複製，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛髮、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。由1983年美國Mullis首先提出構想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。1973 年，台籍科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。 PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

PCR技術

PCR技術是聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction,PCR)，是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重複性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段於數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛髮、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑑定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。

書籍基本信息

書籍封面

內容簡介：《PCR技術》本片為國家“十五”重點音像出版規劃品種、衛生部醫學視聽教材。PCR技術是重要的分子生物學技術，對現代分子生物學的發展起到非常重要的作用。本片通過大量動畫介紹PCR技術的原理及發展史、PCR反應體系、PCR基本操作、PCR擴增產物的檢測、PCR反應條件的控制、PCR實驗中應注意的事項、PCR技術的主要類型等。本片影像清晰，內容豐富，片長34分鐘。本片由山東大學製作，適合醫學院校教學、醫學生自學以及相關科研人員參考使用。《PCR技術》視聽教材，獲得了山東省教育廳頒的山東省第七屆醫學教育二等獎。

PCR技術的基本原理

⑴PCR技術的基本原理：該技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴於DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，藉助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3´-OH末端，並以此為起始點，沿模板5´→3´方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

pcr原理

PCR反應的基本成分包括：模板DNA(待擴增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩衝液。類似於DNA的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的高溫變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的低溫退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的適溫延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈重複循環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留複製鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

⑵PCR的反應動力學：PCR的三個反應步驟反覆進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應”，這種效應稱平台期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情況下，平台期的到來是不可避免的。

⑶PCR擴增產物：可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由於引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3'端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段”。進入第二周期後，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產物片段”)結合。引物在與新鏈結合時，由於新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等於這次延伸的片段3'端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定於引物擴增序列以內、形成長短一致的“短產物片段”。不難看出“短產物片段”是按指數倍數增加，而“長產物片段”則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

PCR反應體系與條件

PCR技術

標準的PCR反應體系：

10×擴增緩衝液　10ul
4種dNTP混合物　各200umol/L
引物　各10～100pmol　
模板DNA0.1～2ug　
TaqDNA聚合酶　2.5u　
Mg2+1.5mmol/L
加雙或三蒸水至　100ul

PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
酶及其濃度：目前有兩種TaqDNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。
dNTP的質量與濃度：dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關係，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。
模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。
Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。

注意事項

PCR技術

擴增長目的片段
當擴增大於5kb的目的片段時，可以使用用於超長PCR的酶或酶混合物以獲得最佳產量。

防止殘餘（Carry-over）污染
PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產物用來進行新的擴增反應時，會發生共同來源的污染。這稱之為殘餘污染。
PCR產物純化
殘餘反應成分包括抑制克隆，測序和標記反應的引物，核苷和熱穩定聚合酶。因此，一般在進一步操作之前需要純化PCR產物。

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