骨髓間充質幹細胞
骨髓間充質幹細胞 Bone Mesenchymal Stem Cells [Bmscs]
幹細胞是一類未分化的細胞或原始祖細胞，其最顯著的特徵是具有慢周期性
和自我更新能力【‘一3]，在合適的條件下可以分化為機體內的許多不同細胞。根據細
胞的發育階段，幹細胞可分為胚胎幹細胞和成體幹細胞，後者又可根據來源不同
分為造血幹細胞、神經幹細胞和間充質幹細胞 (Mesenehymalstemcells，Mses)等。
其中，BMSCS由於其來源廣泛，易於分離培養，並且具有較強的分化潛能和可自
體移植等優點，越來越受到學者們的青睞，被認為是不久即將被引入臨床治療的
最優幹細胞[4]。
1、BMSCS的生物學特性
(1)來源BMscS源於中胚層l5]，存在於全身結締組織和器官間質中，其中以骨髓中含量最為豐富[6]是骨髓中德非造血千細胞，由於其在早期分離培養時對
塑膠培養材料的貼壁特性，過去被稱為集落形成單位成纖維細胞或塑膠貼壁細胞。
同時它也是骨髓中的造血結構性和功能性支持細胞，因此又被稱為骨髓基質細胞。
BMscs在骨髓中含量極少，僅占骨髓細胞比例的0.01一1/萬l7]，並隨年齡的增加而
細胞數量逐漸減少。而且在生理條件20%為靜止期細胞18一9]。BMscS外觀呈梭形、
漩渦狀生長，具有很強的自我複製和橫向分化潛能，在體外特定的誘導條件下可
分化為骨、軟骨、神經、脂肪、肌肉及肝等多種功能細胞，對間質組織如骨、軟
骨、肌鍵、脂肪和骨髓基質的再生也有重要作用[l0一‘6]。由於BMscS相對缺少免疫
，培養技術簡便，體外增殖迅速，並可冷凍保存，因此己成為細胞及基因治
療研究中的種子細胞，具有潛在的臨床套用價值。
(2)表型特徵通過相差顯微鏡觀察發現95階98%體外培養的BMSCs團呈扁
平的紡錘形，與成纖維細胞類似[l7一’9J。BMscs有造血幹細胞生長因子及間質細胞
(CD166)/基質細胞(CD29、CD44)抗原和細胞外基質受體的表達，對造血幹細胞
有支持作用120]。同時，BMscs具有多種表面標誌分子，可表達細胞因子(IL一6、
IL一7、IL一11、IL一8、IL一12、SCF、LIF、M一CSF等)及細胞因子受體(IL一IR、IL一3R、
IL一7R、G一CSFR、pD一GFR等);BMSCS抗原表型並不均一，具有間充質、肌肉和
內皮細胞的特點，即BMSCs可以表達多種豁附相關分子，如整合素亞基a3、a4、
p等。它對表面抗原sBlo、sHZ、SH3、sH4、eD29、eD7r、eDlo6[2‘]等均呈陽
性反應，對CD44更是呈現出高表達特徵。而對於造血幹細胞的CD34、CD45抗
原均呈陰性反應122掛日目前為止，尚未發現公認的BMsCs特異性表面抗原。
(3)生理功能研究表明，BMscS有支持造血細胞和調節免疫的功能[23]它可
以與其他間充質幹細胞構成結締組織支架，同時分泌細胞活素即細胞外基質蛋白，
調節造血細胞的增殖和歸巢。在骨髓中，紅細胞、白細胞、血小板等細胞的分化、
成熟都要依賴於與 BMSCS和細胞外基質及血管組成的微環境的接觸，包括造血細
胞通過表面勃附分子與其直接接觸和其通過分泌多種細胞因子對造血細胞的分化
成熟進行調控。多項研究結果顯示，BMSCs可能是造血微環境中的重要細胞成分。
對於它的調節免疫作用也有許多相關的實驗，例如:94年Ishida等通過對自身免
疫小鼠的骨髓移植實驗指出，BMSCS不僅可以防止免疫移植失敗，而且可以在T、
B淋巴細胞的免疫調節中發揮重要作用。
2、BMSCS的分離培養
對於BMSCS的體外分培養，目前無外乎有一下四種方法:貼壁法、密度梯度離心法[24l、流式細胞術[25l和免疫磁株分選[26]。①.貼壁法也稱全骨髓法，由
Fridenstein在 1987年建立。它主要是根據間充質幹細胞貼壁生長而造血幹細胞懸
浮生長的特性，抽取骨髓後直接加入L一DMEM培養液製成細胞懸液，以合適的細
胞濃度進行培養接種，隨時間延長，不貼壁的造血等細胞隨換液被清除，從而得
到較純化的BMSCS。通過貼壁法分離得到的細胞分化潛能較好，缺點是所得的細
分複雜、細胞純度不足，且培養成功率也很低。②.密度梯度離心法主要是根
據骨髓中細胞成分的比重不同，採用不同密度的percon液或淋巴細胞分離液提取
骨髓單個核細胞進行培養，得到純化的BMSCS。此種方法簡便易行，對細胞活力
影響較小，是目前最常套用的分離方法。③.流式細胞儀法主要是根據BMSCS細
胞體積較小、表面帶有或相對缺少抗原成分進行正選或負選，從而獲得相對純化
的BMSCS。這種方法分離結果令人滿意，但實驗條件要求高，操作複雜，需要骨
髓量大，對細胞活性影響也很大。④免疫磁株法:即套用包被磁株。經單抗體程
序分選BMSCS。它的分選效率較高，但仍沒篩選到其特有的標記分子，尤其是影
響細胞活性，甚至可以導致細胞完全失活
3、BMSCS的體外誘導分化
BMSCs的體外誘導分化方法主要有兩種:一是用抗氧化劑作誘導劑，如:2-琉基乙醇(2一ME)、2%二甲基亞礬(DMSO)、丁經茵醚(BHA)和硫代甘油;二是
用生長因子作誘導劑，如:血小板衍生生長因子(PDGF)，表皮生長因子 p(EGF一內，
肝細胞生長因子 (PGF)和胰導素樣生長因子一1[29]。體外實驗中，在地塞米松、維
生素C、甘油磷酸醋條件下或細胞因子BMP一2或轉化生長因子p作用下，BMscs
可轉化為骨、軟骨和脂肪細胞。V八〕rster等發現，TGF一B可以明顯增加BMSCS的
增殖速度。V此Ikitani等報導，5一氮胞普和兩性黴素一B或兩性黴素一B單獨作用可以
誘導BMSCS分化為成肌細胞。
4、BMSCS的可塑性
BMSCS可以多向分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、成纖維細胞及肝細胞等間葉細胞和其他胚層細胞，即具有可塑性。又加上它容易獲得、
體外擴增10”倍以上而不丟失其多向分化潛能、外源基因易於植入並可整合到間
充質幹細胞的基因組中，穩定表達而不影響其幹細胞特性，植入反應較弱等獨特
優點，因此，在組織修復和基因治療方面的臨床套用潛能越來越受到關注[30l。
(l)向成骨細胞分化種子細胞的選擇是骨組織工程最基本、最關鍵的環節
之一。它的理想種子細胞應具備:取材容易，對機體損傷小;體外培養時增殖能
力強，能穩定表達成骨細胞表型;植入體內可繼續成骨等特點口‘]。據此，Jaiswal
化了成骨的誘導系統，在BMSCs中加入成骨細胞分化培養基(20%的胎牛血
清、Znmol/Lp一甘油磷酸鈉、soug/ml維生素C、lonmol/L地塞米松的DMEM培
養基)，3一4天后梭形細胞比例減少，出現多角形甚至長方形細胞，細胞排列緊
密，部分細胞呈多層生長。21天細胞爬片染色發現有鈣鹽沉積，而未加誘導藥的
對照組未見此變化。尤其是檢測的ALP水平，誘導組ALP活性明顯增加，而對
照組ALP活性仍持續較低水平。這些事實證明BMSCs可分化為成骨細胞用於治
療骨損傷疾病。
(2)向軟骨細胞分化在體外環境下，加入特定的誘導因子和條件，BMSCs
可以分化為軟骨細胞。其中轉化生長因子一印是最主要的誘導因子，生物活性強，
對多種細胞都有生物學效應。在軟骨轉化過程中，它可以促進軟骨細胞合成蛋白
聚糖和11型膠原，並可以保持軟骨細胞表型穩定。此外，地塞米松、胰島素和維
生素C也在軟骨細胞的誘導過程中起著重要作用。除了加入外源性的誘導因子，
也可以通過基因轉染的方法來實現向軟骨細胞的分化。即通過載體把外源基因導
入到BMSCS中，使其在體內長期表達，從而促使其向軟骨細胞的分化。
(3)向心肌細胞分化1999年Makino等首次體外給予3umol/L的5一aza誘導
MSCS定向分化為心肌細胞獲得成功，開創了MSCS體外誘導分化心肌細胞研究
的先河[32]。套用BM一Mscs替代梗死的心肌細胞、治療心肌疾病已是近年來研究的
新課題[33一34]。其分化為心肌細胞的方式有兩種:一是經5一氮雜胞營或兩性黴素B
誘導分化，經此誘導三周后形成肌管結構，心肌特異性Tn一1和肌凝蛋白重鏈陽性，
說明已分化為心肌樣細胞;二是將BMSCs置於心肌內微環境中四周后發現經標記
的BMSCS分化成了心肌細胞，並與周圍心肌細胞形成縫隙連線而同步收縮。
(4)向神經細胞分化神經細胞屬於終末分化細胞，損傷後不能再生，因此
需要尋找一種可以替代的細胞用於神經系統的治療。眾多關於BMSCS在特定條件
下可分化為神經樣細胞的報導表明，BMSCs可作為神經系統疾病治療的候選種子
細胞135]。2001年，Lu等建立鼠栓塞性大腦中動脈閉塞模型，然後將BMscS注入
紋狀體內，實驗組的神經功能恢復明顯好於對照組。由此可見，BMSCS自體移植
治療神經系統疾病是可行的。
(5)向肝細胞分化近年來的體內外實驗證實肝細胞來源於骨髓幹細胞、造
細胞或多能幹成體幹細胞是其原始祖細胞。在肝細胞生長因子(HGF)或表皮
細胞生長因子(EGF)的誘導下，BMscS可分化為肝細胞[36]。
2000年，Oh等[37]將肝細胞生長因子加入到體外培養的大鼠BMscs中，3周
後顯微鏡下可觀察到細胞形態系肝細胞樣，而且用免疫細胞化學法檢測白蛋白、
CK一8、CK一18等肝細胞特異性標誌物呈陽性反應。此實驗說明在體外BMSCS可
以誘導分化為肝細胞。
2003年介rai等[38]將zx一05個經綠色螢光蛋白(OFP)標記的BMseS從尾靜脈
注入CCL4誘導的小鼠肝硬化模型中，一天后發現BMSCs定植於肝小葉門脈周圍，
四周后25%的細胞是BMSCS，並橫向分化為能分泌白蛋白的成熟肝細胞，而對照
組無此表現。實驗結果提示，在肝臟損傷的情況下，BMSCS可橫向分化為肝細胞。
(6)BMSCs與糖尿病對於糖尿病，無論是胰島素依賴性還是非依賴性，目
前都沒有根治性的治療辦法，大多都是依賴於口服降糖藥和胰島素的注射。美國
糖尿病學會表明，對於I型糖尿病，現今根治的唯一辦法就是胰腺移植。但是胰
腺來源有限，且分化的p細胞在體外不能有效的繁殖[39]最近關於胰島素移植成功
的報導[40]使人們對胰島素介導細胞移植產生了興趣。人們試圖利用幹細胞在體外
誘導分化為胰腺細胞，現今關於嚙齒類動物和人類起源的胚胎幹細胞治療糖尿病
已經獲得可喜成績。據Leehner報導:成體組織中提取的幹細胞有治療糖尿病的
潛能，胰島、肝臟和骨髓中含有幾種潛在成人的p細胞或胰島的祖細胞[4l]已有實
驗證實成體幹細胞是產生胰島素細胞的潛在來源細胞，BMSCS存在可能分化為胰
島細胞的可能。一旦BMSCs體外誘導分化為胰島素的p細胞用於治療糖尿病得到
肯定，將會是糖尿病治療方面的一個新的里程碑。
5、BMSCS的臨床套用
目前，BMSCS作為細胞替代之來喔和基因治療的載體已套用於臨床，用來治療中樞神經系統病變，如帕金森病、老年痴呆症等，以及心肌缺血、周圍神經損
傷、退行性關節炎等。
(1)在中樞神經系統疾病中的套用帕金森病是一種以中腦黑質一紋狀體系
統的多巴胺能神經元變性，導致分泌多巴胺遞質降低，引起四肢僵硬，靜止震顫
等錐體外系症狀的疾病。Park等將基質細胞來源的神經營養因子(GDNF)轉入到
森病模型鼠體內，發現轉入神經營養因子的BMSCS對黑質細胞有保護作用，
這表明BMscS在中樞神經系統退化疾病中有治療作用[42].它可以通過細胞替代彌
補中樞神經疾病或損傷引起的神經功能缺損，同時能分泌多種白細胞介素和乾細
胞因子、造血調節因子等幫助缺血腦組織的功能恢復。因此，BMSCS的套用為中
樞神經系統損傷修復提供了新的治療方法[43]。
(2)在心肌缺血疾病中的治療作用有研究者用BMSCs移植來增強血管的發
生和改善心臟的局部缺血。將BMSCS體外誘導成的心肌細胞移植到心肌缺血的動
物模型體內。兩個月後，植入的BMSCS在梗死區內呈現血管內皮生長因子的高水
平表達並伴有血流量的改變。它使肥大的肌細胞減少和左心室的收縮性明顯改善。
這表明，BMSCS可以用於臨床治療心肌缺血。
(3)對損傷神經的修復作用Dez~[44]等將體外培養的BMscS轉染綠色熒
光蛋白，移植入體內神經缺損處，最終BMSCs分化為具有神經膜細胞功能和性質
的細胞，並可以誘導細胞再生。從而達到修復受損神經的作用。
(4)臨床治療退行性關節炎疾病有臨床報導，將體外培養的BMSCS自體移
植入病人的關節腔中，能夠重新形成關節面。陳克明[45]等將體外培養的兔自體
BMSCS與纖維蛋白複合在一起回植入關節軟骨缺損區，實驗發現第2、4周，軟
骨再生情況非常理想，缺損區內充滿軟骨細胞，第12周，再生軟骨細胞分化為典
型的透明軟骨樣結構。臨床證明，BMSCS可以用於治療退行性關節炎。
當然，BMSCS在其他方面也有治療作用。如對於椎間盤的再生牙周組織的修
復146]等也已取得肯定的療效。
6、存在問題及套用前景
雖然BMSCS在骨、心肌、神經系統的治療等方面的研究已經取得了很大的進展，但對於該領域的研究尚處於探索階段，很多問題有待解決:
(1)對BMSCs本身特性的研究和在組織工程方面的利用研究，都希望利用純
的幹細胞成分，但實驗證明體外分離的BMSCS均為各種細胞的混雜。如何才能更
有效地獲得純化地BMSCs，有待於對其細胞學特點和分化各階段細胞標誌物的研
究。
(2)BMSCS的增殖和分化的控制需要合適的條件。如何能既控制增殖、避免
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，又能在適當的時候開始所需路徑的分化，還有待進一步研究。
(3)BMSCsI’司的相互作用、其與造血幹細胞間相互作用、BMSCS與不同成熟
階段的細胞的相互作用直接對其生長、分化產生影響，但目前這些作用的機制還
不清楚。
(4)對BMSCS在各種動力學條件下的組織改變還知之甚少，而BMSCS在骨
髓中及用於骨組織工程顯然要受到周圍環境的力的作用。對這方面的研究將促進
對該細胞的全面理解和有效利用。
(5)植入心肌或神經組織後的遠期效果尚未得到有效評估。
儘管如此，幹細胞與其他的種子細胞相比，仍具有不可忽視的優點，例如:
取材方便，有強大的增殖分化潛能，不存在免疫排斥反應147]，能在體外較穩定的
擴增等。因此，隨著我們對BMSCS研究的進一步深入，它的優點將被充分挖掘，
它將作為一種新型的基因治療的靶細胞，廣泛套用於心血管和神經系統疾病的治
療，解決肝移植、肝細胞移植和人工肝等治療肝源短缺的問題148]，成為人類疾病
臨床治療方面的又一巨大突破。
