脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

ol,DON)等。 DON的飼料後,蛋和肉中檢測不出DON。 等“用DON的濃度為0、l、5、10

英文名稱(縮寫)

Deoxynivalenol(DON)

發現歷史

DON是一種單端孢霉烯族毒素,主要由禾穀鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產生。DON是諸罔信一等在1970年首先從日本香川縣感染赤霉病的大麥中分離到的。1973年,Vesohder從美國俄亥俄州西北部導致母豬拒食和嘔吐的被禾穀鐮刀菌污染的玉米中分離得到該毒素;並根據它能引發動物嘔吐的特徵,將其定名為嘔吐毒素(Vomitoxin,VT)。
國內1976年從上海市金山縣赤霉病元麥中分離出能使鴿子口服的致吐的純品。徐一純等(1979)從田間感染禾穀鐮刀菌的赤霉病大麥中分離得到一種新的嘔吐毒素,定名CBD2。

鐮刀菌產生的黴菌毒素

黴菌毒素是各種黴菌在適當的溫度、濕度和基質中產生的高毒性代謝產物。麴黴、青黴和鐮刀菌是產生毒素的最主要黴菌。至今人們已知道大約有300種不同的黴菌毒素,但僅有少數被認為與畜禽疾病有關係。黴菌毒素的大量攝入,經常會引起急性中毒表現,然而少量攝取,則產生非異性的臨床表現,例如,食物攝取量降低、生長不良、增重緩慢、死亡率增加、免疫抑制等。而單端孢霉烯族毒素是糧食中最常見的一類污染性黴菌毒素,由鐮刀菌產生,包括T-2毒素、雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol,NIV)、玉米赤霉烯酮(Zearalmone)、伏馬菌素(Fumonisin)、鐮刀菌烯酮.X(Fusarenon.X,FX)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)等。可對人、畜產生廣泛的毒性效應,如食慾降低、體重減輕、代謝紊亂等。

理化特性

DON毒素的化學結構

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為雪腐鐮刀菌烯醇的脫氧衍生物,其化學名稱為3, 7, 15-三羥基-12,13-環氧單端孢霉-9-烯-8酮(3,7,15-trihydroxy-12, 13-epoxytricho thec-9-en-8-one),分子式為C15H20O6,分子量為296.3,結構式如圖所示。
DON結晶為無色針狀,熔點為151~153℃,α, β-不飽和酮基致使其在短波紫外下有吸收峰。但此紫外吸收與其它許多物質紫外吸收相重疊,並非特徵性的。可溶於水,易溶於甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯等極性溶劑,具有較強的熱抵抗力和耐酸性,在乙酸乙酯中可長期保存。
DON在中性及酸性條件下比較穩定,對溫度也很穩定,在鹼性條件下容易被破壞。

對糧食的污染現狀

赤霉病除了造成糧食減產,籽粒品質等經濟損失外,由該病菌產生的單端孢霉烯(Trichothecenes)類毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)及其乙酸化衍生物3-AcDON和15-AcDON嚴重威脅食品安全。單端抱霉稀族化合物是一類倍半薛攤類化合物,其中以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)毒性最強,對穀物的污染率和污染水平居鐮刀菌毒素之首,同時DON常與其他真菌毒素共存,被食後可以共同作用於人體,對人類健康造成了很大的威脅。
研究表明,DON還具有很強的細胞毒性和胚胎毒性,能引起人類食管癌、IgA腎病、克山病和大骨節病等,因此該毒素已被聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)確定為最危險的自然發生食品污染物之一。
世界上大多數國家對於食品中的DON都做了明確的限量規定,2005年我國衛生部和國家標準化管理委員會發布的《食品中真菌毒素限量》(GB2761-2005)中規定小麥和玉米中的脫氧雪腐鐮刀菌稀醇DON的限量指標為Img/kg;GB20833-2007規定豬飼料中DON的限量為1 mg/kg;聯合國糧農組織規定食用糧食中DON不得超過1 mg/kg。2010年5月15曰,國家糧食局發展司何毅司長在回答記者提問時指出,我國南方和長江流域糧食和詞料中真菌毒素污染問題比較嚴重。2008-2009年,教育部動物抗病營養重點實驗調查全國11個省的1081份飼料樣品的毒素污染情況發現,DON毒素的檢出率達95.8%,超標率達17.7%。
2008年12月-2009年5月,江蘇農科院樊平聲和安徽農科院張勇等人對南京市場上隨機抽取的74份小麥食品(包括速食麵、餅乾、麵包和蛋糕等)中DON的含量進行了測定,結果發現有37份樣品中DON的含量高於1 mg/kg的限量標準,產自福建、上海、廣東、浙江、安徽、江蘇和河北的小麥食品中DON毒素含量的平均值分別為 2.12、2.39、3.50. 1.86、1.72. 1.22 和 1.55 mg/kg,均超過 1 mg/kg的限量標準。
2007年,Binder等人對亞太地區釆集的丨290份代表性樣品分析發現,DON的檢出率達71%,其中毒素含量最高的樣品來自中國的小麥,其DON含量為丨8.99 mg/kg,超標近18倍。
可見,解決我國DON毒素污染問題已不容忽視,真菌毒素污染的問題已經越來越受我國和全世界的關注,並且控制赤霉病流行成災是防治DON毒素污染問題的重要途徑。

毒性

DON在體內可能有一定的蓄積,但無特殊的靶器官,具有很強的細胞毒性。人畜攝入了被DON污染的食物後,會導致厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、站立不穩和反應遲鈍等急性中毒症狀,嚴重時損害造血系統造成死亡,但不同的動物對DON的敏感程度不一,豬最敏感。

致癌致畸致突變作用

國內外對 DON 的致癌、致畸、致突變作用的研究結果多數表明它們具有致畸、胚胎毒性及弱致癌性。Irerson 等(1995-1996)用進行 DON 的慢性毒性實驗,病理學檢查發現 B6C3F1 大鼠有肝臟腫瘤病變。
王加生等(1996)用赤霉病麥粗毒素純化物和病麥提取物中的 DON 純品做 Ames實驗發現,發現 DON 毒素對於鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型具有致突變作用。流行病學研究發現,DON 的含量與食管癌的發生呈正相關。
Vesely(1995)等研究了 DON毒素對 3 日齡雞胚的毒性作用,孵化後發現的毒性作用劑量範圍很窄,發現實驗組雞胚頭部及身體發育畸形。

對動物的毒性

低劑量DON,主要引起動物的食慾下降,體重減輕、代謝紊亂等症狀,大劑量可導致嘔吐。動物對DON的反應有種屬和性別差異,雄性動物對毒素比較敏感,豬比小鼠、家禽和反芻動物更敏感。
DON常與豬的抗拒綜合症有關。豬飼料中的DON含量超過1μg/kg時,進食量顯著降低,甚至拒食,體增重低於正常豬水平,同時還伴有嘔吐。在豬飼料中添加純DON則會降低飼料進食量,進食量的降低與添加濃度成反比。DON中毒的豬,一個症狀是拒食,出現“僵豬”,玉米里如有10 mg/kg的毒素含量就會引起豬的拒食,這種拒食到底是因毒素對消化道的局部刺激作用,還是由於適口性不良造成的,尚未有定論;DON對牛、羊和成年雞鴨則不出現拒食現象。乳牛似乎對DON不敏感,但低產牛群飼餵含DON的飼料也全發生疾病。雞採食含DON高達18 mg/kg的飼料無明顯有害影響。當雞進食含9.18 mg/kg DON的飼料後,蛋和肉中檢測不出DON。火雞飼餵含5 mg/kg DON的飼料也無明顯有害影響。
Iverson等“用DON的濃度為0、l、5、10 mg/kg的飼料飼餵雄、雌性大鼠,2年發現動物體重增加與DON劑量呈負相關。雌性大鼠的血漿中IgA、IgG濃度較對照組增高,生化指標、血液學指標也可見明顯異常。病理學檢查還發現有肝臟腫瘤、肝臟損害。
Banotai等用含20 mg/kg DON的飼料飼餵雌性B6C3F1小鼠13周,發現體重明顯減輕,血清IgA升高,而IgM和IgG降低,腎小球系膜IgA沉積出現血尿。
Szkudelska等研究發現,Wistar大鼠皮下注射1 mg/kg DON,3 d後血中胰島素、葡萄糖和自由脂肪酸的含量明顯增高,還可引起肌肉合成糖原增加和三醯甘油降低。
李群偉等的研究表明,DON能使家兔的心、肝、腎和脾的組織細胞出現腫脹、空泡變性、炎性細胞浸潤及細胞壞死的病理變化。

對人的毒性

人誤食DON以後急性中毒症狀一般出現在0.5 h後。快的可在10 min後出現,主要症狀是頭昏、腹脹、噁心、嘔吐,以及白細胞缺乏症。一般在2 h後可自行恢復。老人和幼童,或大劑量中毒者,症狀較重,呼吸、脈搏、體溫及血壓均略有升高,但未見死亡。

對細胞的毒性

DON具有很強的細胞毒性,它對於原核細胞、真核細胞、植物細胞和腫瘤細胞等均具有明顯的毒性作用。它對於生長較快的細胞如胃腸道黏膜細胞、淋巴細胞、胸腺細胞、脾細胞和骨髓造血細胞等均有損傷作用,並且可以抑制蛋白的合成。
研究發現,DON可明顯抑制豬卵母細胞的成熟,同時DON還可使培養的豬子宮內膜細胞減少,一些細胞出現了線粒體腫脹、細胞膜破裂和細胞漿空泡化等細胞死亡的表現。另外,FCM檢測表明DON影響細胞周期的分布,抑制細胞進入S期,使細胞阻停滯在G0/G1期,具有明顯的抗增殖作用。
彭雙清和楊進生研究表明,DON對培養心肌細胞B、L和T三型Ca通道均有明顯的阻滯作用,使三型Ca通道的開放機率減少,開放時間縮短,關閉時間延長。
李月紅等研究表明,DON能抑制人外周血單個核細胞的HLA-1分子、TAP-1、低分子量蛋白酶體-2的表達。
Thuvander 等(1999)研究發現,高低濃度的 DON 毒素可劑量依賴地分別抑制體外培養的人淋巴細胞增殖及免疫球蛋白的產生和導致免疫球蛋白的升高;
Islam 等(2003)研究了細菌脂多糖(LPS)和 DON 聯合套用對小鼠胸腺 T 細胞亞群、骨髓 B 細胞亞群和集合淋巴結凋亡誘導的影響,可明顯促進胸腺內成熟和非成熟的淋巴細胞凋亡。
彭雙清等(1994)報導 DON 毒素可使大鼠心肌細胞去極化過程發生改變,動作電位、最大除極速度(Vmax)、超射(OS)及閾電位(TP)均減小,部分參數指標存在較明顯的劑量效應關係。DON 對雞胚關節軟骨細胞有明顯的毒性作用,其超微結構的改變主要為軟骨細胞膜的損傷。
林林等(2004)研究發現 DON 對 Vero 細胞 DNA 有損傷,隨染毒劑量增加,染毒時間延長,受損傷細胞的數量逐漸增加,細胞 DNA 損傷程度逐漸加重。

對免疫功能的影響

DON污染糧穀類的情況相當普遍,其對免疫功能的影響已受到了醫學工作者的重視。二十世紀以來,隨著分子生物學技術的發展,DON對免疫系統的影響引起人們極大的興趣。DON既是一種免疫抑制劑。又是一種免疫促進劑,其作用與劑量和作用時間有關。動物研究發現,DON可以明顯抑制動物的免疫機能,能誘導小鼠胸腺、脾、小腸黏膜集合淋巴的T細胞、B細胞和IgA細胞發生凋亡。還有研究表明,免疫抑制作用表現為DON通過其倍半萜烯結構抑制轉錄、翻譯和蛋白合成過程;而免疫增強作用與DON干擾機體正常免疫調節機制有關。在體內,DON既可以抑制機體對病原體的免疫應答,同時又可以誘發自身免疫反應。此外,DON誘導免疫細胞凋亡、抑制其增殖。同時還可以超誘導輔助性T細胞產生細胞因子,激活巨噬細胞、T細胞產生炎症前細胞因子。DON對免疫系統的毒作用主要表現在具有明顯的急性和慢性毒性作用,引起食慾下降、嘔吐、體重減輕和代謝紊亂;在細胞水平有明顯的細胞毒作用,引起細胞的損傷;根據濃度和作用時間不同,對免疫細胞因子既可表現為抑制,又可表現為超誘導;可誘導並促進免疫細胞的凋亡、抑制其增殖;促進IgA分泌,抑制IgM和IgG的分泌。

神經毒性

DON毒素可以穿過血腦屏障(BBB)對人體神經系統造成損傷。(待補充)

DON的檢測

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇可從穀物(小米、玉米、大麥等)及其製品(蛋糕、餅乾、麵包等)中通過薄層色譜法和免疫測定方法檢出。根據DON經對甲基苯甲醛噴霧後呈現黃色的特性,可用薄層層析檢測法作定性檢測。DON還可以用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行微量檢測。

膠體金試紙檢測

採用膠體金測試條法對糧食中嘔吐毒素進行快速定量檢測,結果表明,嘔吐毒素的檢測限為118 μg/ kg,定量限為316 μg/ kg,500 ~5 000μg/ kg 質量濃度範圍內,相關係數r 為0.9987.。採用有證實物參考物質進行比較,正確度為90.3% ~ 116.6%,變異係數為4.7% ~ 19.6%.。採用配對t檢驗,與高效液相色譜法的測定結果相比較,二者無顯著差異。

物理化學方法

常用的物理化學檢測方法有薄層層析法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。TLC法具有靈敏度高、顯色方便和可同時檢出幾種毒素等優點,缺點是樣品提純較繁瑣,需要使用標準毒素,易造成環境污染。HPLC法具有快速、靈敏度高、準確和自動化等優點,多用於毒素的微量分析,尤其是毒素在組織中殘留量的測定,但由於儀器價格昂貴,難以在基層推廣套用。魏潤蘊用TLC法檢測出DON。此後,他用氣相色譜法在天然污染穀物的提取液中檢測出低含量的DON。
高效液相譜法測定DON需要將樣品用乙腈-水(84∶16)溶液提取,提取液通過MycoSepTM227和MultiSepTM216柱淨化、濃縮,C18色譜柱分離,紫外檢測器檢測,外標法定量。對添加兩個水平嘔吐毒素的玉米樣品進行加標樣回收實驗,平均回收率為84.13%和88.14%,最低檢測限為2μg/kg。

免疫學方法

酶聯免疫法(ELISA)利用抗嘔吐毒素的特異性單克隆抗體和包被抗原,建立間接競爭酶聯免疫法(ELISA)來檢測穀物及其製品中嘔吐毒素含量。酶聯免疫法試劑盒的最低檢測濃度10μg/L;平均RSD 為5.8%;回收率平均值為104%;用該方法研製的測試盒在4℃環境下可穩定6 個月以上;檢測時間小於2 h。
目前國內用於DON檢測的ELISA試劑盒很少,而實現商品化的更少。所以實驗室可自行製備DON的單克隆抗體。為製備一種嘔吐毒素單克隆抗體(McAb),對DON進行改造,合成了半抗原,然後與載體蛋白BSA、OVA分別偶聯合成偶聯抗原DON-BSA、DON-OVA,並對合成的偶聯抗原進行鑑定。然後用DON-BSA作為免疫抗原,DON-OVA作為檢測抗原免疫小鼠製備抗DON的單克隆抗體。
通過穀物及其製品中嘔吐毒素的檢測試驗, 將檢測嘔吐毒素的兩種免疫技術(金標試紙法和酶聯免疫法)進行了比較, 考察兩種方法的符合率。結果表明兩種方法測定結果基本一致, 符合率達100%。

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