細胞周期檢驗點

細胞周期檢驗點

細胞周期檢驗點(checkpoint)是細胞周期調控的一種機制,主要是確保周期每一時相事件有序、全部完成並與外界環境因素相聯繫。細胞要分裂,必須正確複製DNA和達到一定的體積,在獲得足夠物質支持分裂以前,細胞不可能進行分裂。細胞周期的運行,是在一系列稱為檢驗點的嚴格檢控下進行的,當DNA發生損傷,複製不完全或紡錘體形成不正常,周期將被阻斷。

基本信息

分裂過程

細胞周期檢驗點細胞周期檢驗點
細胞周期(cellcycle)是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程,分為間期與分裂期兩個階段。
間期
間期又分為三期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成後期(G2期)。
1.G1期(firstgap) 從有絲分裂到DNA複製前的一段時期,又稱合成前期,此期主要合成RNA和核糖體。該期特點是物質代謝活躍,迅速合成RNA和蛋白質,細胞體積顯著增大。這一期的主要意義在於為下階段S期的DNA複製作好物質和能量的準備。
2.S期(synthesis) 即DNA合成期,在此期,除了合成DNA外,同時還要合成組蛋白。DNA複製所需要的酶都在這一時期合成。
3.G2期(secondgap)期為DNA合成後期,是有絲分裂的準備期。在這一時期,DNA合成終止,大量合成RNA及蛋白質,包括微管蛋白和促成熟因子等。
分裂期
M期:細胞分裂期。
細胞的有絲分裂(mitosis)需經前、中、後,末期,是一個連續變化過程,由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。一般需1~2小時。
1.前期(prophase)染色質絲高度螺鏇化,逐漸形成染色體(chromosome)。染色體短而粗,強嗜鹼性。兩個中心體向相反方向移動,在細胞中形成兩極;而後以中心粒隨體為起始點開始合成微管,形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質的螺鏇化,核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內質網。
2.中期(metaphase)細胞變為球形,核仁與核被膜已完全消失。染色體均移到細胞的赤道平面,從紡錘體兩極發出的微管附著於每一個染色體的著絲點上。從中期細胞可分離得到完整的染色體群,共46個,其中44個為常染色體,2個為性染色體。男性的染色體組型為44+XY,女性為44+XX。分離的染色體呈短粗棒狀或髮夾狀,均由兩個染色單體借狹窄的著絲點連線構成。
3.後期(anaphase)由於紡錘體微管的活動,著絲點縱裂,每一染色體的兩個染色單體分開,並向相反方向移動,接近各自的中心體,染色單體遂分為兩組。與此同時,細胞波拉長,並由於赤道板細胞膜下方環行微絲束的活動,該部縮窄,細胞遂呈啞鈴形。
4.末期(telophase)染色單體逐漸解螺鏇,重新出現染色質絲核仁;內質網囊泡組合為核被膜;組胞赤道板縮窄加深,最後完全分裂為兩個2倍體的子細胞
分類
根據在細胞周期(cellcycle)中的時間順序,可將checkpoint分為三類
1:G1期(Restriction)Checkpoint
2:G2Checkpoint
3:MetaphaseCheckpoint(細胞分裂期,M期)

主要檢驗點

①G1/S期檢驗點:主要檢驗DNA是否損傷、能否啟動DNA的複製,作用是防止DNA損傷或是突變的細胞進入S期。ATM、ATR是感受DNA損傷信號的上游因子,當DNA受到損傷後二者被激活,從而使多種蛋白質磷酸化,其中磷酸化的p53能夠在細胞中積累,激活p21等一系列基因的轉錄,P21可抑制CDK2活性,並可結合到CDK4周期蛋白結合物上,從而抑制對Rb磷酸化,低水平磷酸化的Rb蛋白使轉錄活化因子(E2F)不能脫離Rb控制,失去轉錄活化因子的作用,這樣細胞被阻斷在G1/S,不能開始DNA複製。
②S期檢驗點:檢驗DNA在S期複製過程中是否受到損傷,DNA複製完畢才能進入G2期。ATM、ATR由於DNA損傷而被激活,由兩條路徑感受和傳遞DNA損傷信號,結果一方面是暫時地可逆抑制尚未起始的複製起始位點,使DNA複製速度減慢甚至停止;另一方面是ATM激活與DNA修復有關的蛋白質促使DNA的修復過程,S期細胞中損傷DNA需要得到有效修復後才能通過S期檢驗點。
③G2/M期檢驗點:是決定細胞一分為二的控制點,主要檢測DNA是否損傷細胞中合成的物質是否夠多,細胞的體積是不是足夠大等。作用是使得細胞有充足的時間將損傷的DNA得以修復。細胞DNA損傷後,激活ATM、ATR以及下游的chk1或chk2通過下調cdc25,上調weel,最終使CDK1/周期蛋白B的活性受到抑制,導致細胞被阻斷在G2/M交界處。另外,p53和P21在G2/M檢驗點也起重要作用,可能是通過對CDK1/周期蛋白B活性的抑制作用來實現的。
④中-後期檢驗點:紡錘體組裝的檢驗,作用是抑制著絲點沒有正確連線到紡錘體上的染色體,確保紡錘體正確組裝。Mad2和Bub1是位於動粒的APC負調控因子,如果染色體被微管捕獲,二者消失,反之則不消失,而Mad2可與cdc20結合,抑制cdc20活性,從而使APC活性受到影響,作為後期促進因子的APC可以調節M期周期蛋白的降解,但APC活性受到抑制,M周期蛋白降解受到影響,姐妹染色單體不能分離,從而阻止了細胞從有絲分裂中期向後期的過渡,保證了複製後的染色體能夠均等地分配到兩個子細胞中。染色體的任何一個著絲點沒有正確連線紡錘體上都會引起細胞周期中斷在有絲分裂中期和後期的交界處。

工作方式

分類

從檢查點的工作方式來看,又可分為三個部分
1:探測器(sensor),負責檢查質量問題;
2:感測器(signaltransducer),負責信號傳遞;
3:效應器(effector),由效應器去中斷細胞周期進程並開動修復機制。

步驟

Ⅰ、樣品準備
A、組織單細胞懸浮液(如淋巴腺、脾、骨髓、胎盤細胞)
B、組織培養細胞
C、Ficoll-hypaque分離的單核細胞
Ⅱ、反應體系-DNA低滲緩衝液
檸檬酸三鈉0.25g
Triton-X1000.75ml
Propidiumiodide0.025g
核糖核酸酶0.005g
蒸餾水250ml
我們將該DNA低滲溶液於密閉瓶子中存放數月後並無發現有任何染色活性的丟失
Ⅲ、染色
1、每一個管子中放入1×106個細胞;
2、樣品離心後儘可能完全地移去上清液,並且不要打碎沉澱塊;
3、加入1ml的DNA低滲染色(可用甲基綠進行染色)緩衝液至沉澱中,並混勻;
4、樣品於4℃下避光30分鐘或最長不超過1個小時以備流式細胞儀分析。
注意:延長在低滲緩衝液的曝光時間會引起樣品碎片的增加。
細胞周期檢測可以作為生物相容性評價指標,示例如下:套用體外細胞培養法,觀察不同質量分數羥基磷灰石浸提液對L-929細胞的細胞學形態的影響,同時採用MTT比色法評價羥基磷灰石對L-929生長和增殖的影響,流式細胞儀檢測羥基磷灰石浸提液對L-929細胞生長周期及凋亡的影響。結果表明,羥基磷灰石浸提液對體外培養的細胞形態無明顯影響,對細胞生長和增殖無明顯抑制作用;不同質量分數材料浸提液的細胞毒性為0~1級,隨羥基磷灰石浸提液質量分數的升高,細胞凋亡率逐漸上升;50%、75%、100%羥基磷灰石浸提液組能明顯降低G0/G1期細胞比例,增加S,G2/M期細胞比例,能增加L-929細胞DNA的合成,促進細胞生長和組織修復

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