底物化學發光

辣根過氧化酶使試劑中的發光物(luminol)氧化並發光,而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍。在免疫印跡中,將複雜的蛋白混合物經sds-page分離,並轉移到固相膜上(如nc、pvdf)等,用於免疫學檢測,經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接(標記一抗)或間接(標記二抗)反應。

英文名字

Chemiluminescent

原理

辣根過氧化酶使試劑中的發光物(luminol)氧化並發光,而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍。在免疫印跡中,將複雜的蛋白混合物經sds-page分離,並轉移到固相膜上(如nc、pvdf)等,用於免疫學檢測,經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接(標記一抗)或間接(標記二抗)反應。當加入免疫印跡化學發光試劑後,luminol發生氧化降解,並發射波長為428nm的光,此光可經x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。

用途

非放射性發光系統,用於檢測固定在膜上的蛋白,其敏感性達1-5pg。用x光片可快速地獲得永久的硬拷貝結果。所含獨特的底物足以維持12小時以上的發光,便於反覆曝光操作,免疫印跡膜經抗體脫卸處理後可供再次抗體探查使用。適用於痕量蛋白或核酸檢測。

使用方法

1. 印跡膜製備 按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作,適當的封閉非常重要。可以通過標記一抗或二抗的手段引入HRP,一般採用市售的HRP二抗交聯物。仔細地淋洗對於降低背景非常重要,在與HRP交聯物溫育後,膜片更需仔細洗滌,所有步驟均在室溫下完成。

2. 化學發光試劑的配置 在使用前等量混合a液和b液,混合後儘快使用。將膜片置混合液中於室溫下振盪溫育2分鐘,每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。

3.蛋白信號顯現

1). 用平頭鑷鉗住膜片,垂直置於吸水紙以吸去過量試劑。

2). 置膜片於二層保鮮膜之間,小心趕盡氣泡。

3). 將膜片吸附蛋白面朝上,置於x光片盒中。

4). 於暗室中壓上x光片。

5).根據信號的強弱適當調整曝光時間,一般為1min或5min,也可選擇不同時間多次壓片,以達最佳效果。顯影沖洗。

6). 調節曝光時間,再次曝光顯影。

4、膜的重複使用:

配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液,膜放入後,70?c振盪水浴30分鐘。再用tbst或pbst緩衝液洗脫,最後用bsa(牛血清白蛋白)或牛奶封閉。

操作注意

1. 試劑每個批號均獨立最佳化,請不要混用或稀釋試劑以免降低敏感性;

2. 加入一抗後膜不能再乾燥;

3. 適當地封閉和洗滌膜片至關重要;

4. 使用前配置化學發光試劑,配置足夠覆蓋膜片即可,棄去使用過的混合試劑;

5. 使用乾淨取樣頭取用每種試劑;

6. 第一張片子建議曝光1分鐘,觀察結果後判斷最佳曝光時間可從30秒至2小時不等;

7. 除了放射自顯影片曝光和洗片處理外,所有步驟均不必在暗室中操作;

8. 膜片可經適當方法洗脫原有抗體,再次印跡使用,在此情況下,此試劑更為理想;

9. 因為它不象生色物質需要從膜片上清除底物。

10. nan3能抑制HRP活性,應避免使用nan3。

安全性

無特殊毒性,按普通化學品處理。如果不慎與眼、皮膚和衣物接觸,請立刻用大量清水沖洗。

儲存

2-8℃密封避光保存一年。

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