不利用光能或無機物的氧化能而進行二氧化碳的固定。主要的例子有渥德-瓦克曼反應。現已證實不論是自養還是異養的生物,就生物的所有主要群體來說,具有代表性的種,都進行二氧化碳的暗固定,作為三羧酸循環的中間體而生成二羧酸。與暗固定有關的二氧化碳固定酶,因生物種類不同而異。代表者有丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘋果酸酶等。
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