主要分類
RACE技術一般分5-和3-RACE兩種。
3-RACE較簡單，首先將mRNA或總RNA用PolyT引物反轉錄，根據一般基因具有polyA尾巴的特點，選用特異引物(根據已知序列設計)和PolyT引物PCR即可。大多實驗者反映一次PCR可以搞定。
5-RACE相對較難，目前流行幾種5-RACE。其一為加接頭(傳統)，根據接頭引物和自己設計特異引物PCR，可以設計巢式PCR二次擴增。另外，有利用反向PCR技術，連線成環在PCR。還有，GENE公司一種smartRACEPCR，利用反轉酶末斷加C特點,直接加上多G接頭，轉換模板而無需用連線酶加接頭。
發展歷史
RACE技術經典的RACE技術是由Frohman等(1988)發明的一項技術，主要通過RT-PCR技術由已知部分cDNA序列來得到完整的cDNA5’和3’端，包括單邊PCR和錨定PCR。該技術提出以來經過不斷發展和完善，克服了早期技術步驟多、時間長、特異性差的缺點(Frohman等，1995：Schaefer，l995：Chen，1998：Bespalova等，1998：Matz等1999)。對傳統RACE技術的改進主要是引物設計及RT-PCR技術的改進：改進之一是利用鎖定引物((lockdockingprimer)合成第一鏈cDNA,即在oligo(dT)引物的3′端引入兩個簡併的核苷酸【5′-Oligo(dT)16_30MN-3′,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始點，從而消除了在合成第一條cDNA鏈時oligo(dT)與poly(A)尾的任何部位的結合所帶來的影響；改進之二是在5‘端加尾時，採用poly(C)，而不是poly(A)；改進之三是採用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反轉錄酶或選擇嗜熱DNA聚合酶可能在高溫h(60度-70度)有效地逆轉錄mRNA，從而消除了5‘端由於高CC含量導致的mRNA二級結構對逆轉錄的影響；改進之四是採用熱啟動PCR(hotstartPCR)技術和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反應的特異性。 隨著RACE技術日益完善，目前己有商業化RACE技術產品推出，如CLONTECH的MarathoTM技術和SMARTTMRACE技術術。邢桂春等(2001)先後使用上述兩種試劑盒進行RACE反應，結果發現使用MarathonTM所得到的片斷總是比採用SMARTsup]TMRACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在於MarathonTM技術反轉錄反應往往不能真正達到mRNA的5’末端。所以認為，進行RACE反應應當優選SMARTTMRACE試劑盒。
引物設計
基因特異性引物（GSPs）應該是：
1、23－28nt
2、50－70％GC
3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以獲得好的結果需要實驗者根據已有的基因序列設計5‘和3‘RACE反應的基因特異性引物（GSP1和GSP2).由於兩個引物的存在，PCR的產物是特異性的。
4、cDNA的合成起始於polyA+RNA。如果使用其它的基因組DNA或總RNA，背景會很高。
5、RACEPCR的效率還取決於總的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸溫度。
6、在進行5‘和3’RACEPCR的時候應該使用熱啟動。
7、重疊引物的設計會對全長的產生有幫助。另外，重疊的引物可以為PCR反應提供一個對照。並不是絕對的要利用設計的引物產生重疊片段。
8、引物GSP中的GC含量要在50－70％之間。這樣可以使用降落PCR。避免使用自身互補性的引物序列，否則會產生回折和形成分子內氫鍵。另外，避免使用與AP1互補的引物，尤其是在3‘末端。
9、如果要用重疊片段來檢測設計的引物，GSp1和GSp2之間至少是100－200鹼基。只有這樣才可以用擴增的產物來鑑定設計的引物是否正確。
10、降落PCR可以明顯的增加RACEPCR產物的特異性。在最開始的循環中，退火溫度高於AP1引物的Tm值，可以增加對特異性條帶的擴增。隨後的退火和延伸的溫度降回到AP1的溫度，可以進行隨後的PCR循環。
11、驗證基因特異性引物的對照：
單個引物的陰性對照：只用一個引物GSP來進行陰性對照。這樣不應該產生任何的條帶。如果可以看到明顯的產物，應該改變循環的參數，或重新設計原始引物。
利用兩個GSPS進行陽性對照：（只有兩個GSP可以產生重疊的時候才可以採用此步。）為了確定RNA樣品中目的基因確實表達，利用兩個GSP和接頭連線的cDNA來產生陽性對照。可以產生兩個引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個片段，應該重複cDNA的合成，或者從一個不同的組織或細胞來源進行cDNA的合成。
12、製備和抽提polyA+RNA不要使用DEPC處理過的水。純化完mRNA之後，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質量。哺乳動物的mRNA樣品是0.5－12kb的拖帶，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的條帶。非哺乳動物的mRNA應略小。
比較與最佳化
RACE技術目的：研究環化法、末端脫氧核糖核酸轉移酶法和SMART反轉錄酶法3種常用5'RACE的技術的特點，並對它們進行了最佳化。
方法：以播娘蒿RNA為模板，先按文獻標準方法進行5'RACE，然後通過增加反應時間，提高部分反應物濃度等方法進行最佳化。
結果：未最佳化前環化法和TdT酶法條帶幾乎不可見，SMART反轉錄酶法隱約可見條帶，但不清晰。最佳化條件後，環化法出現彌散條帶，TdT酶法勝之，但條帶依舊彌散，而SMART反轉錄酶法最佳，獲得清晰特異性條帶。結論SMART5'RACE效果最好，其次為TdT酶法，環化法效果有待改進，同時通過最佳化條件可以明顯增加產物的特異性，為實驗研究中5'RACE方法的選擇提供了依據。
實驗步驟
cDNA第一條鏈的合成：
我們建議進行cDNA合成的對照反應，這樣可以對樣品的cDNA的合成進行鑑定。加入各種試劑之後，在氣浴中42度保溫一個小時。
注意：在水浴或酒精浴中保溫回減少反應體積，從而降低第一鏈的合成效率。將管放於冰上，以終止第一鏈的合成反應。直接進行第二鏈的合成。
cDNA第二鏈的合成：
第二鏈合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和連線酶。T4DNA聚合酶的功能是補平dscDNA的末端。我們建議做陽性對照，試劑盒中提供人類骨骼肌的mRNA。
1、建議進行陽性對照,cDNA的質量取決於製備的polyA+RNA的質量。非哺乳動物樣品的mRNA大約在0.5－3kb之間。
2、通過電泳檢測cDNA的產量，與對照進行對比，這樣可以有利於在以後的步驟中對cDNA進行稀釋。
3、按照程式進行連線反應。
4、如果沒有對比樣品和對照的產量，利用Tricine－EDTAbuffer製備接頭連線的dscDNA的1/50和1/250的稀釋物，用兩種稀釋物進行RACEPCR反應，直到鑑定出哪一種稀釋可以得到好的效果。
PCR擴增
RACE技術進行5’和3’的RACE－PCR擴增。
利用以下的程式進行降落PCR反應：
94度30秒
5個循環：
（1）94度5秒
（2）72度4分
5個循環：
（1）94度5秒
（2）70度4分鐘
20－25個循環：
（1）94度5秒
（2）68度4分鐘
注意：
我們建議使用降落PCR反應，這就要求GSP的Tm值≥70度。
1、當循環結束時，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析每一個管中的產物5μl，使用適當的分子量marker。
2、可以根據你的基因的特異性來設計最理想的循環參數。如果看不到帶或者只有微弱的帶，在68度多加5個循環。最佳的延伸時間取決於擴增條帶的長度。如果片斷的長度在2－5kb的時候，經常使用4min，0.2-2kb的時候將延伸時間減到2－3min，對於5－10kb的條帶，延伸時間增加到10min。
目前遇到的問題及解決方法
實驗中發現，做RACE反應實驗實際操作中仍存在不少困難。因此，對RACE反應條件進行反覆摸索是十分必要的。這是因為：
1. 在5'-RACE包含了有3個連續的酶反應步驟（反轉錄、同聚物加尾和PCR擴增），每一步都可能導致失敗；
2. 擴增DNA末端的特異性完全依賴錨定引物及擴增DNA模板樣品的不均一性，因而特異性一般很低，常呈現不清晰的成片條帶或截短的產物背景。因此，使用RACE技術擴增得到的特異末端片段，所獲得的重組克隆最好能夠全部測序，以排除RACE實驗結果中擴增產物假陽性和假陰性，最終有可能獲得新基因的全序列。
隨著RACE的不斷改進和完善，最佳化條件下PCR擴增效率和忠實性的提高及PCR產物克隆技術的迅速發展，RACE必將在基因克隆及基因表達研究中發揮越來越大的作用。
RACE的另一種代表方法-Self-Ligation法
反轉錄(RT)反應------Hybrid RNA的分解------單鏈cDNA的自身連線------PCR擴增5'未知區域------目的DNA片段的切膠回收------DNA序列測定
克隆和測序
1、可以利用膠回收試劑盒來回收RACE產物，此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物；對於長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法，最後用Tricine－EDTAbuffer30μl重新懸浮DNA樣品。2、電泳5μl回收的樣品來鑑定回收的質量。
3、將回收的PCR產物直接克隆到/A型的PCR克隆載體中。另外還可以利用接頭和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位點，將產物克隆到常規載體中。
4、對於5‘端的RACE產物，我們建議挑取至少8－10個不同的克隆以獲得5‘端的最大可能性的序列。（反轉錄並不總是進行到mRNA模板的5’末端，尤其是長模板。另外，T4DNA聚合酶會移走5‘末端的0－20個鹼基。）
5、一旦鑑定了含有插入片斷的克隆，應該獲得多的序列信息。理想的是，可以對整個開放讀碼框進行測序。包括5‘和3‘的非翻譯區。
cDNA的獲得
RACE技術通過部分或全部測序鑑定了RACE產物後，可以通過兩種選擇獲得全長的cDNA。通過PCR和克隆的方法。 通過PCR的方法獲得全長cDNA：
1、擴增長的cDNA需要較長的延伸時間，但是如果延伸的時間過長，可以產生拖帶，所以要慎重的設計引物。
2、根據從5‘和3‘RACE產物獲得序列信息設計5’和3‘GSP引物。這些引物應該來自cDNA的3’或者5‘的末端，應該是23－28nt長。不應該在引物的末端加上限制性位點，這樣會導致高背景。在某些時候可以設計3’和5‘的嵌套引物。但是還是應該先利用一對引物進行PCR反應。
3、進行如下的熱循環：
94度30秒
25個循環：
（1）94度5秒
（2）72度2－15分鐘
4、延伸的時間應該等於預期的cDNA長度加上2分鐘。例如：預期得到6kb的條帶，用6＋2＝8分鐘的延伸時間。注意：如果沒有條帶或者條帶弱，增加5個循環；或者最佳化PCR的條件。
5、在1.2%的瓊脂糖凝膠上分析5μl的樣品。通常情況下，可以見到一條單一帶，如果這樣，利用膠來純化全長的cDNA。
6、製備1.2%的TAEbuffer製備瓊脂糖凝膠。不使用TBEbuffer，TBE的膠很難製備全長的cDNA。
7、將剩下的45μl反應物點樣，選用適當的marker。
8、利用長波紫外觀察cDNA（≧300nm）切下全長的cDNA。注意：應該儘量減少紫外對cDNA的照射。
9、利用膠回收試劑盒回收cDNA。此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物；對於長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法，最後用Tricine－EDTAbuffer30μl重新懸浮DNA樣品。
10、將全長的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆載體中。
通過克隆產生全長的cDNA：
1、如果你已經獲得了含有重疊部分的5‘和3’RACE產物，同時在cDNA的重疊部分含有一個酶切位點的話，通過克隆技術可以獲得全長的cDNA。
2、利用酶切獲得的3‘和5’擴增產物，並且利用T4DNA連線酶將它們連線起來。利用接頭和cDNA合成引物中的內切酶將最終的全長cDNA克隆到載體中。
3、在哺乳動物基因組中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大約106bp才出現一次，因此在絕大多數的cDNA中是不出現的。
