但是,第一次十字軍遠徵結束後,醫院騎士團的宗旨開始發生變化,他們的首領決定:一部分教友繼續為飢餓和染病的朝聖者從事慈善工作,但其中心任務是建立一支訓練有素、紀律嚴明的騎士軍,從而逐步變成了純粹的封建騎士軍事團體,並在巴勒斯坦地區存在了將近200年。其服裝是綴有白色十字架的黑色外套,後來又改為紅色外套。
14世紀初,在奧斯曼土耳其帝國的進逼之下,騎士團不得不於1310年移到地中海東部的羅得島。1522年,奧斯曼蘇丹蘇里曼一世為了解除進犯歐洲的後顧之憂,大舉進攻羅得島,雖然騎士團只有500多名騎士和6000多名士兵,但他們面對20萬強敵,毫不畏懼,英勇抵抗,進行了整整半年多的頑強防禦戰,雖然最終被迫投降,但土軍卻付出了至少5萬人喪生的慘重代價。蘇里曼一世對騎士團的勇氣頗為讚賞,於是特許這支敵軍在1523年1月1日安全撤離了該島。
1530年,神聖羅馬帝國皇帝查理五世同意把馬爾他島及其附近的戈佐島交給醫院騎士團管轄。於是,醫院騎士團就在馬爾他島上建立了自己的國家,正式稱為"馬爾他騎士國"。
此後,醫院騎士團進入了鼎盛時期,船帆上標有馬爾他八角十字的戰船橫行於地中海。18世紀,騎士團的疆域遠達美洲西印度群島的聖克魯瓦。1794年,美國獨立後不久,這個騎士國就很快對它予以承認,並同它建立了外交關係。在當時,馬爾他騎士國比美國還要強大得多呢。
1798年,拿破崙率領的法國軍隊在遠征埃及的途中,將騎士團從馬爾他島上趕了出去,騎士團再度淪落天涯,直到1834年才在義大利的羅馬扎了根。此後,它們再度轉向經營慈善事業,一直延續到今天,其名稱也改為"耶路撒冷、羅得島和馬爾他聖約翰軍事護理人員騎士團"。