尿環磷腺苷

環腺苷酸作為肽類激素的第二信使,在激活蛋白激酶,使核糖體中蛋白質磷酸化,加速“翻譯”過程和促進特異性蛋白質的合成等方面起著非常重要的作用。臨床上測定環腺苷酸對多種疾病診斷和療效判斷有一定意義。

別名

尿環磷酸腺苷

尿環磷腺苷的醫學檢查

檢查名稱

尿環磷腺苷

分類

體液和排泄物檢查 > 尿液檢查

尿環磷腺苷的測定原理

cAMP是一種小分子半抗原,其特異性抗體是以人工合成的2'-0-ScAMP-BSA結合物免疫動物所獲得。抗體對2'-0-位有取代基的cAMP的親和力較無取代基的cAMP約大100倍。為提高測定方法的靈敏度高,測定時應將[3H]標記cAMP,樣品和標準同時進行琥珀醯化反應,然後和抗體反應。從標準曲線查出樣品中的濃度。

試劑

(1)抗血清:

①ScAMP的合成:取cAMP20mg,琥珀酸酐100mg至反應瓶中,加去離子水2ml,三乙胺0.2ml,磁力攪拌反應30min。置真空乾燥內減壓除去三乙胺。加水20ml,放24h,用1mol/L NH4OH調至pH7.0。即刻用強鹼型聚苯乙烯陰離子交換柱層析。0.3mol/L甲酸淋洗,收集258nm流出液。合併,冷凍乾燥,產物為ScAMP。

②取ScAMP:經偶聯劑作用和BSA結合,作為免疫原,注射山羊或家兔,製備抗血清。

(2)[3H]-ScAMP:取[3H]-cAMP(中國原子能研究院產品)92.5kBq(2.5μCi)至瓶中,加琥珀酸酐5mg,去離子水0.1ml,三乙胺10μl,即刻混合,用力搖45s,加50mmol/L pH6.2醋酸緩衝液至10ml,臨用前配製。

(3)50mmol/L pH6.2醋酸鹽緩衝液:取AR級無水醋酸鈉4.1g於800ml蒸餾水中,加茶鹼1.44g,溶解後用2mol/L醋酸調至pH6.2,加蒸餾水至1000ml,4℃保存。

(4)標準cAMP液(320nmol/L):取純化cAMP1.11mg,加50mmol/L pH6.2醋酸鹽緩衝液10ml,微溫至溶,放-20℃可長期保存。

(5)標準cAMP(320pmol/瓶):取標準cAMP液0.2ml至10ml容量瓶中,加去離子水至10ml刻度。取5ml帶塞瓶,每瓶加50μl,放37℃乾燥,4℃水箱可保存3年內穩定。

(6)醯化試劑:取200mg/ml琥珀酸酐丙酮液2.5ml,三乙胺0.9ml混合,臨用前新配。

(7)閃爍液:取PPO 4g,POPOP 100mg,加AR級二甲苯1000ml。

操作方法

(1)尿液採集:稀釋後取尿液3ml,即刻加至預先放有0.25mol/L EDTA Na2 50μl的冷試管中,迅速混勻,放-20℃保存。

取尿液1ml至提取管中,加無水乙醇3ml,置快速混勻器上1min,離心,上清液傾至15ml蒸發皿中,向沉澱物中加75%乙醇3ml重複提取一次。上清液合併,置55℃水浴上吹乾。殘渣溶於0.5ml50mmol/L pH6.2醋酸鹽緩衝液。

(2)組織樣品處理:活組織取得後即刻置氮氣中,快速稱取30~50mg於研磨器中,加50mmol/LpH6.2醋酸鹽緩衝液1ml,製成勻漿後即刻放沸水浴中3~5min。離心,取上清液放-20℃保存。

(3)標準工作液:取標準cAMP一瓶,加50mmol/L pH6.2醋酸鹽緩衝液1ml。另取試管7隻,各加50mmol/L pH6.2醋酸緩衝液0.5ml,從標準液中吸出0.5ml至第一管,依次作倍比稀釋。此系列標準液50μl中含有0.125~8pmol。臨用前稀釋。

(4)10mm×100mm玻璃試管,NSB管加緩衝液150μl,S0管加緩衝液50μl,S1~7管加不同濃度標準液50μl測定管加待測樣品50μl。

(5)向每管加醯化試劑10μl,即刻用力搖5~10s。各管加[3H]-ScAMP液50μl。

(6)除NSB管外,各加抗血清100μl。混勻,放4℃反應2.5h。向每管加冷緩衝液1ml。

(7)將反應液滴加至聯接抽氣泵的微孔濾膜上抽濾,再加2ml冷緩衝液洗滌反應管,亦加至膜上抽濾。取下濾膜,放80℃ 30min。

(8)將濾膜放至預先加有5ml閃爍液的計數瓶中,放2h後在自動液體閃爍測量儀上測放射性。

(9)以B0/B為縱坐標,標準管濃度為橫坐標,在普通方格紙上作圖,可得y軸截距為1的直線。依樣品管的B0/B值,從標準曲線上得至相對應的濃度。再乘10得cAMPnmol/L。

正常值

3H-標記法:2.5~4.7nmol/mg·肌酐

化驗結果臨床意義

(1)升高:尿毒症、高鈣血症。

(2)降低:甲狀腺功能減退、支氣管哮喘、甲狀旁腺功能減退。

附註

(1)醯化試劑必須新鮮配製。琥珀酸酐丙酮液放4℃冰櫃保存不應超過1個月。

(2)微孔薄膜分離B·F成本低廉,閃爍液可重複使用5次以上。該法為非均相測量,測量放射性的效率約20%~25%。

相關疾病

高鈣血症、支氣管哮喘

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